Teknologi derivatisasi adalah suatu proses kimia yang mengubah struktur molekul dari senyawa asam amino menjadi senyawa yang lebih mudah untuk dideteksi dan dianalisis. Pada analisis asam amino, teknologi derivatisasi diperlukan untuk mengubah asam amino yang berbentuk polar dan tidak mudah berdifusi menjadi senyawa yang lebih mudah terdeteksi dan dapat dianalisis secara kromatografi cair atau gas.
Salah satu teknologi derivatisasi yang umum digunakan dalam analisis asam amino adalah teknologi derivatisasi dengan menggunakan agen pengubah fluoresensi seperti fluorenylmethyloxycarbonyl (FMOC), dansil klorida, atau asam 9-fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc). Agensi pengubah fluoresensi ini akan bereaksi dengan gugus amina pada asam amino dan menghasilkan senyawa turunan fluoresen yang mudah dideteksi dan diukur dengan spektrofotometer fluoresensi.
Teknologi derivatisasi juga dapat digunakan untuk membedakan dan memisahkan asam amino yang strukturnya serupa. Misalnya, teknologi derivatisasi asam amino dengan menggunakan reagen kiral seperti asam 3,5-dinitrobenzoat (DNB) dapat membedakan asam amino yang memiliki sifat optis yang berbeda seperti D-aminosav dan L-aminosav.
Dengan demikian, teknologi derivatisasi sangat penting dalam analisis asam amino karena dapat membantu meningkatkan sensitivitas, spesifisitas, dan kualitas analisis yang dilakukan.
Gambar 1 Struktur dan mekanisme pewarnaan Ninhydrin
Dalam analisis asam amino pra-kolom-derivatisasi, umumnya gugus amino dari asam amino yang diturunkan.
Pra-perawatan untuk membuat turunan fluoresen sering dilakukan. Tujuan dari hal ini antara lain sebagai berikut:
- Untuk memastikan bahwa hanya senyawa amino (yaitu asam amino) yang berpendar, sehingga asam amino dapat dideteksi secara selektif.
- Untuk memungkinkan peningkatan sensitivitas secara nyata, melalui deteksi fluoresensi.
- Dalam banyak kasus, turunannya telah meningkatkan hidrofobisitas, memfasilitasi pemisahan dengan HPLC fase balik. Dalam kombinasi dengan peningkatan perangkat dan kolom secara terus-menerus, pra-perawatan fluoresensi memungkinkan perancangan dan peningkatan dalam resolusi timbal balik asam amino.
Seperti ditunjukkan pada Gambar. 2, berbagai senyawa yang tersedia secara komersial dan terkenal digunakan sebagai reagen derivatisasi, termasuk orto -phthalaldehyde (OPA; λ ex .: 245 nm; λ em .: 395 nm), 6-aminoquinolyl- N – hidroksisuksinil imida (AQC; λ ex .: 245 nm; λ em .: 395 nm), 4-fluoro-7-nitrobenzofurazane (NBD-F; λ ex .: 470 nm; λ em .: 530 nm), 9-fluorenylmethyl kloroformat (FMOC; λ ex .: 340 atau 350 nm; λ em .: 450 nm), dan fluorescein-4-cyanate (FITC; λ ex .: 390 nm; λ em.: 520nm). Selain itu, banyak senyawa lain telah dikembangkan, dan sejumlah tinjauan telah dipublikasikan 11, 12) . Namun, beberapa reagen, seperti OPA, bereaksi hanya dengan amina primer, dan karena itu diperlukan kehati-hatian dalam hal ini.
Sehubungan dengan kemajuan dalam kromatografi cair / spektrometri massa (LC/MS) dan LC / spektrometri massa tandem (LC/MS/MS) dalam beberapa tahun terakhir, reagen derivatisasi pra-kolom telah dikembangkan untuk teknik ini sebagaimana diterapkan pada analisis asam amino.
Gambar. 2 Struktur molekul dari reagen derivatisasi pra-kolom yang representatif
Reagen derivatisasi fluoresen digunakan untuk memerlukan struktur molekul seperti untuk membuat asam amino berfluoresensi, sedangkan dalam kasus banyak reagen untuk analisis MS, disediakan substruktur yang meningkatkan efisiensi ionisasi (Gbr. 3). Dalam kasus MS/MS khususnya, rasio sinyal/noise meningkat tajam. Ada juga sejumlah laporan tentang pemanfaatan penuh MS/MS, untuk mencapai pembelahan turunan reguler, dan dengan demikian mengembangkan berbagai metode analisis memanfaatkan kemajuan ini; dan juga tentang kelayakan pengukuran ultra-cepat (untuk detailnya, lihat referensi 13) sampai 15) .
Gambar 3 Struktur molekul reagen derivatisasi pra-kolom untuk LC/MS/MS ( p – N , N , N -trimethylammonioanilyl N ‘-hydroxysuccinimidyl carbamate iodide; TAHS), turunan yang dihasilkan, dan situs pembelahan pada MS/MS